腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSC)是目前臨床腫瘤治療的主要障礙。外泌體是一種包含circRNAs的囊泡，參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的通信。然而，乳腺CSC (BCSC)外泌體的作用仍不清楚，本研究的目的是研究BCSC外泌體中的circRNAs對乳腺癌細(xì)胞代謝的重編程。circCARM1在BCSC外泌體中的含量高于親本乳腺癌細(xì)胞中的含量。進(jìn)一步研究表明，BCSC外泌體circARM1通過miR-1252-5p/PFKFB2在乳腺癌細(xì)胞糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。綜上所述，BCSC外泌體來源的circARM1通過海綿吸附miR-1252-5p調(diào)控PFKFB2的表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。本文于2022年1月發(fā)表于Oncogene（IF=9.867）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）BCSC外泌體介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞糖酵解

為了研究BCSC對乳腺癌細(xì)胞功能的影響，我們采用微球形成法擴(kuò)增BCSC。MDA-231細(xì)胞在低附著板的干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖1a)。使用乳腺球分析干細(xì)胞特征，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)記物CD44、SOX2、OCT4和ALDH1A1在CSC中在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上的表達(dá)水平較高(圖1b、c)。為了探索BCSC外泌體在調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞功能中的作用，我們制備并觀察了來自乳腺癌細(xì)胞球(S-exo)或其親本細(xì)胞(P-exo)的外泌體(圖1d)。外泌體標(biāo)記物進(jìn)行免疫印跡分析(圖1e)。當(dāng)用S-exo或P-exo處理MDA-231細(xì)胞時(shí)，S-exo處理的細(xì)胞比P-exo處理的細(xì)胞顯示出更多的生存能力(圖1f)。為了探索CSC外泌體在調(diào)節(jié)腫瘤糖酵解和糖酵解能力中的作用，我們使用S-exo或P-exo處理乳腺癌細(xì)胞，S-exo處理的細(xì)胞比P-exo處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞外酸化率(ECAR)(圖1g, h)。經(jīng)S-exo處理的MDA-231細(xì)胞表現(xiàn)出較低的耗氧率(OCR)，表明線粒體呼吸受到抑制，ATP生成顯著減少(圖1i, j)。此外，S-exo培養(yǎng)的癌細(xì)胞有較高的糖酵解酶的表達(dá)，包括GLUT1、HK2、丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)、3-磷酸肌醇依賴激酶1 (PDK1)和LDHA(圖1k)。這些數(shù)據(jù)表明CSC-exo增加了癌細(xì)胞的有氧糖酵解。

2）BCSC外泌體的circRNA譜

為了研究來自CSC外泌體的circRNA對乳腺癌細(xì)胞表型影響，我們制備了S-exo和P-exo來進(jìn)行circRNA陣列分析。熱圖顯示上調(diào)和下調(diào)的circRNA有兩倍以上的折疊(圖2a)。外泌體中最豐富的circRNA長度為200-800 bp(圖2b)。circRNA資源顯示，78%的circRNA來自外顯子(圖2c)。在乳腺癌細(xì)胞和MCF10A細(xì)胞中檢測circCARM1的表達(dá)，MDA-231、MDA-468、BT549細(xì)胞中circCARM1的表達(dá)高于其他細(xì)胞株(圖2d)。circCARM1水平在CSC外泌體中比在P-exo中顯著上調(diào)(圖2e)。檢測乳腺癌組織中circCARM1的表達(dá)，結(jié)果顯示65例乳腺癌組織中circCARM1的表達(dá)高于癌旁正常組織。circCARM1在乳腺中的平均表達(dá)水平較高(圖2f))。FISH檢測證實(shí)乳腺癌組織中circCARM1表達(dá)水平高于癌旁正常組織(圖2g)。為了進(jìn)一步確認(rèn)乳腺癌組織外泌體中circCARM1的水平，我們將新鮮的乳腺癌組織制備成球狀以獲得外泌體，并收集外泌體(圖2h)，如圖2i所示。結(jié)果顯示，乳腺癌球形體的外泌體中circCARM1的含量高于相鄰正常組織的外泌體(圖2j)。結(jié)果表明，circCARM1在組織和細(xì)胞S-exo中富集，可能在乳腺癌中作為癌基因發(fā)揮作用。

3）circCARM1的環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)的鑒定及臨床特征

CircCARM1 (circ_0004552)源于CARM1基因，該基因位于第3染色體(chr3:157839891-157841780)，由基因組長度4257 bp的外顯子2、3和4的頭尾剪接組成(圖3a)。對MDA -231和MDA-468細(xì)胞中circCARM1在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的豐度進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)circCARM1主要位于細(xì)胞質(zhì)中(圖3b)。乳腺癌細(xì)胞中circCARM1的FISH分析顯示，circCARM1存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖3c)。為了研究circCARM1是否對RNase R有反應(yīng)，我們在MDA-231和BT549細(xì)胞中對總RNA進(jìn)行預(yù)消化，對RNase R處理后的circCARM1和CARM1 RNA進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明circCARM1對RNase R有抗性(圖3 d)。為了了解circCARM1和CARM1的RNA穩(wěn)定性，我們用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素Dat處理細(xì)胞，數(shù)據(jù)顯示circCARM1轉(zhuǎn)錄物相對于CARM1 mRNA是穩(wěn)定的(圖3e, f)。

4）來自BCSC外泌體的circCARM1增加了乳腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解

為了了解來自BCSC外泌體的circCARM1在癌細(xì)胞中的作用，circCARM1被慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲除(圖4a)。在細(xì)胞中下調(diào)circCARM1后，乳腺癌細(xì)胞生存能力受到抑制(圖4b)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，circCARM1下調(diào)介導(dǎo)細(xì)胞周期相位分布(圖4c)。將circCARM1下調(diào)的S-exo和P-exo與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，評估糖酵解作用。數(shù)據(jù)表明，通過S-exo處理，ECAR降低(圖4d)。在S-exo存在和circCARM1下調(diào)的情況下，癌細(xì)胞的糖酵解和糖酵解能力被抑制(圖4e)。在MDA-468細(xì)胞中也有類似的結(jié)果(圖4f, g)。與P-exo處理的細(xì)胞相比，S-exo處理的癌細(xì)胞表現(xiàn)出更低的OCR(圖4h)、ATP生成和最大呼吸(圖4i)，然而，抑制外泌體circCARM1則逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。在MDA-468細(xì)胞中也有類似的結(jié)果(圖4j, k)。通過實(shí)時(shí)RT-PCR(圖4l, m)和western blotting(圖4n)，我們還發(fā)現(xiàn)糖相關(guān)基因在具有circCARM1下調(diào)的外泌體的MDA-231和MDA-468細(xì)胞中被下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明circCARM1參與了癌細(xì)胞糖酵解。

5）EIF4A3調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中circCARM1的表達(dá)

為了探究circCARM1的生物發(fā)生，circRNA相互作用(https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html)顯示，在circCARM1 pre-mRNA的上游和下游，EIF4A3有5個結(jié)合位點(diǎn)(圖5a)。采用RIP驗(yàn)證EIF4A3能通過抗EIF4A3抗體通過這些假定的結(jié)合位點(diǎn)與CARM1 pre-mRNA結(jié)合(圖5b)。此外，qRT-PCR檢測顯示，過表達(dá)EIF4A3促進(jìn)了circCARM1的表達(dá)，而下調(diào)EIF4A3則抑制了乳腺癌細(xì)胞中circCARM1的表達(dá)(圖5c, d)。western blot分析顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，敲除circCARM1可以抑制糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)，而這種影響可以通過共轉(zhuǎn)染EIF4A3表達(dá)載體來逆轉(zhuǎn)(圖5e)。臨床上，EIF4A3與乳腺癌組織中circCARM1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖5f)。這些數(shù)據(jù)支持了EIF4A3促進(jìn)circCARM1的生物發(fā)生。

6）乳腺癌細(xì)胞中circCARM1與miR-1252-5p結(jié)合

CircInteractome (CircInteractome .nia.nih.gov)預(yù)測了circCARM1和miRNA的相互作用，其中一個潛在的miRNA為miR-1252-5p，并顯示了結(jié)合位點(diǎn)(圖6a)。為了研究潛在的靶miRNA，我們設(shè)計(jì)了一個生物素化的circCARM1探針，該探針被證實(shí)可以拉下癌細(xì)胞中的miRNA, miR-1252-5p在乳腺癌細(xì)胞中被circCARM1探針大量拉下(圖6 b, c)。通過生物素化的miR-1252-5p探針，證實(shí)circARM1在MDA-231和MDA-468細(xì)胞中被miR-1252-5p拉下(圖6d)。通過熒光素酶報(bào)告基因檢測，miR-12525p過表達(dá)顯著降低了轉(zhuǎn)染含有完整circCARM1序列的載體的細(xì)胞的熒光素酶活性(圖6e)。FISH研究顯示，circCARM1和miR-1252-5p共定位于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖6f)。乳腺癌組織中miR-1252-5p顯著下調(diào)(圖6g)。Pearson相關(guān)分析顯示，在乳腺癌組織中miR-1252-5p與circCARM1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6h)。

7）circCARM1通過miR-1252-5p調(diào)控PFKFB2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

我們使用目標(biāo)預(yù)測引擎(包括targescan、miRanda和miRWalk)識別候選目標(biāo)(圖7a)。其中，我們選擇了10個在乳腺癌中表現(xiàn)出顯著表達(dá)失調(diào)的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)PFKFB2在乳腺癌組織中較正常癌旁組織表達(dá)上調(diào)(圖7b)。數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)一致(圖7c)。通過異位表達(dá)circCARM1可以增加PFKFB2的表達(dá)(圖7d)，通過抑制circCARM1的表達(dá)可以降低PFKFB2的表達(dá)(圖7e)。為了證實(shí)miR-1252-5p調(diào)控PFKFB2，我們構(gòu)建了一個基于熒光素酶的報(bào)告基因質(zhì)粒。用miR-1252-5p模擬物和報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞可顯著降低PFKFB2的熒光素酶活性(圖7f)。在miRNA-1252-5p過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株中，PFKFB2顯著降低(圖7g)。PFKFB2通過過表達(dá)circCARM1恢復(fù)(圖7h)。相反，過表達(dá)miR-1252-5p后PFKFB2表達(dá)下調(diào)，circCARM1可部分恢復(fù)下調(diào)(圖7i)。Pearson相關(guān)分析顯示circCARM1和PFKFB2在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)呈正相關(guān)(圖7j)。乳腺癌標(biāo)本中miR-1252-5p和PFKFB2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖7k)。這些結(jié)果表明PFKFB2是miR-1252-5p的靶基因，在乳腺癌細(xì)胞中受到circCARM1的調(diào)控。

8）PFKFB2部分挽救了外泌體circCARM1對癌細(xì)胞糖酵解的影響

為了解circCARM1在PFKFB2調(diào)控的乳腺癌細(xì)胞糖酵解中的作用，乳腺癌細(xì)胞外泌體中下調(diào)circCARM1或過表達(dá)PFKFB2。干擾circCARM1后，細(xì)胞生存能力被抑制，PFKFB2可以挽救這種進(jìn)展 (圖8a,b)。細(xì)胞集落形成也用于驗(yàn)證結(jié)果(圖8 c, d)。circCARM1的下調(diào)降低ECAR，PFKFB2可以挽救MDA-468和MDA-231細(xì)胞ECAR的下降(圖8e-h)。經(jīng)S-exo處理的癌細(xì)胞顯示出較低的OCR，PFKFB2可以挽救經(jīng)S-exo/CARM1處理的細(xì)胞中OCR的上調(diào)(圖8i, j)。與對照組相比，缺氧條件下circCARM1過表達(dá)導(dǎo)致基底OCR明顯降低，最大OCR顯著降低。相反，在缺氧條件下，circCARM1的下調(diào)導(dǎo)致了基底和最高水平的OCR升高。在另一個細(xì)胞株BT549中，結(jié)果是一致的(圖8k, l)。通過western blotting檢測，circCARM1和PFKFB2過表達(dá)后，GLUT1、HK2、PKM2等糖酵解標(biāo)志物增強(qiáng)(圖8m)。因此，我們認(rèn)為來自乳腺癌細(xì)胞外泌體的circCARM1增強(qiáng)了PFKFB2調(diào)控的細(xì)胞糖酵解作用。

9）circCARM1在乳腺癌體內(nèi)的生物學(xué)意義

為了進(jìn)一步證實(shí)來自CSC外泌體的circCARM1在體內(nèi)促進(jìn)乳腺癌的作用，我們建立了Balb/c裸鼠乳腺癌原位模型。使用MDA-231細(xì)胞與來自circCARM1下調(diào)的親本細(xì)胞的CSC外泌體建立模型(圖9a)。生長曲線如圖9b所示。實(shí)時(shí)成像顯示，circCARM1 shRNA組的平均腫瘤大小遠(yuǎn)小于sh-NC組(圖9c)。S-exo/circCARM1 shRNA組腫瘤的重量比sh-NC組輕(圖9d)。我們對小鼠血清中的circCARM1水平進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)在S-exo處理的小鼠中circCARM1升高，而在circCARM1下調(diào)的小鼠中circCARM1降低(圖9e)。將切除的腫瘤進(jìn)行石蠟包埋切片，檢測Ki67、PFKFB2。S-exo/ circCARM1 shRNA小鼠的Ki67、CD44、HK2、PFKFB2和LDHA水平低于對照組(圖9f)。結(jié)果還顯示，在S-exo/circCARM1 shRNA處理的小鼠組織中，PFKFB2的表達(dá)被抑制，LDHA和HK2也被下調(diào)(圖9g)。結(jié)果表明circCARM1在促進(jìn)乳腺癌生長中發(fā)揮了重要作用。

結(jié)論：該研究表明，乳腺癌細(xì)胞或新鮮組織的球狀體中的外泌體中circCARM1上調(diào)。circCARM1可以作為miR-1252-5p的海綿，在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)PFKFB2的表達(dá)，參與乳腺癌糖酵解。

參考文獻(xiàn)：Liu Y, Ma L, Hua F, Min Z, Zhan Y, Zhang W, Yao J. Exosomal circCARM1 from spheroids reprograms cell metabolism by regulating PFKFB2 in breast cancer. Oncogene. 2022 Jan 13. doi: 10.1038/s41388-021-02061-4. Epub ahead of print. PMID: 35027669.